El mundo de las gotas dentro de nuestras células The world of drops within our cells

Introducción

La célula es la unidad básica de la vida. Todos los organismos vivos están construidos sobre estas unidades extraordinariamente sofisticadas.^[1] El metabolismo celular mantiene a los sistemas biológicos fuera del equilibrio de manera continua, resistiendo un deslizamiento natural hacia la descomposición y la muerte celular. Para resistir esta deriva inevitable hacia el equilibrio, las células requieren un aporte constante de energía. En los organismos vivos, esta energía proviene de los nutrientes, que se descomponen mediante reacciones metabólicas controladas. La energía liberada se captura en formas químicas que impulsan los procesos moleculares necesarios para la actividad celular. Un desafío clave para las células es gestionar la transformación constante de muchas moléculas diferentes de manera coordinada y eficiente. Para entender cómo se logra esto, es necesario saber la organización y los procesos que ocurren dentro de las células.

Organizar el desorden

Las células están formadas por moléculas orgánicas e inorgánicas. Entre ellas se encuentra un conjunto de macromoléculas clave, como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN), las proteínas, los polisacáridos y los lípidos, que son fundamentales para la estructura y las funciones celulares. En conjunto se denominan biomacromoléculas.

Para que una célula funcione correctamente, sus componentes moleculares deben estar organizados con precisión. De lo contrario, ello conduciría a cortocircuitos entre diversas rutas químicas y, eventualmente, a la muerte celular. Una estrategia sencilla para evitar este caos es separar las moléculas químicas requeridas para una tarea específica de aquellas necesarias para otra, utilizando una bolsa o compartimento. Repetir este proceso permite obtener una colección de compartimentos para cada función específica. De manera notable, la naturaleza llegó a la misma solución y creó una serie de bolsas para distintas funciones, llamadas orgánulos. El núcleo, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, los lisosomas, etc., son algunos ejemplos de orgánulos que permiten a las células llevar a cabo tareas complejas de manera ordenada. Los orgánulos se pueden clasificar en dos categorías principales según si están encerrados por una membrana o no: (i) orgánulos delimitados por membrana y (ii) orgánulos sin membrana, ver figura 1(A).

Orgánulos delimitados por membrana (ODM)

Como su nombre indica, la característica principal de los orgánulos delimitados por membrana (ODM) es la frontera que separa la matriz del orgánulo de la matriz celular (citoplasma). Estas fronteras o membranas están generalmente formadas por bicapas lipídicas, lo que permite la transferencia selectiva de moléculas entre las matrices. Orgánulos como el núcleo, el retículo endoplásmico, las mitocondrias, los lisosomas y el aparato de Golgi son ejemplos notables de ODM, ver figura 1(A). El núcleo fue el primer orgánulo descubierto por Robert Brown en 1831 mientras estudiaba las orquídeas.^[2] Sin embargo, los cuerpos de Golgi fueron los primeros orgánulos descritos en detalle por Camillo Golgi en 1898 mientras estudiaba las células nerviosas.^[3] Por lo tanto, nuestro entendimiento de los ODM se remonta a casi dos siglos, y han sido fundamentales para encontrar soluciones a diversos problemas médicos y para curar enfermedades.^[6,7]67

Orgánulos sin membrana (OSM)

Los orgánulos que carecen de membrana para separar su matriz molecular del citoplasma circundante se denominan orgánulos sin membrana (OSM). El primer OSM descubierto fue el nucléolo en 1835 por Rudolf Wagner y Gabriel Valentin.^[5] El descubrimiento de los cuerpos de Cajal por Santiago Ramón y Cajal en 1903 en las neuronas abrió el camino para el hallazgo de muchos otros orgánulos de este tipo, incluidos los gránulos germinales, los cuerpos P y los gránulos de estrés, ver figura 2.^[8,9]89

Un cambio de paradigma importante en la comprensión de los OSM ocurrió en 2009, cuando Anthony Hyman y Cliff Brangwynne demostraron que los gránulos P en C. elegans se comportan como gotas con comportamiento líquido, capaces de fusionarse y deformarse.^[10] Este trabajo proporcionó la primera evidencia directa in vivo de que ciertos compartimentos celulares pueden ensamblarse sin membranas mediante la separación de fases líquido-líquido de biomacromoléculas, ver figura 1(B). Como resultado, los OSM ahora se denominan en términos generales condensados biomoleculares. Estos condensados ofrecen una fase rica en solutos de biomacromoléculas que pueden exhibir un intercambio molecular rápido con el entorno circundante, permitiendo funciones celulares dinámicas pero organizadas espacialmente.^[11]

Funciones de los condensados

Los condensados biomoleculares desempeñan diversas funciones en la regulación del ARN, catálisis, señalización, organización del genoma y desarrollo celular. El nucléolo, los cuerpos de Cajal, los cuerpos P y los gránulos de estrés regulan el procesamiento del ARN y la expresión génica, mientras que los condensados de enzimas metabólicas, los cuerpos de Balbiani y el nucléolo actúan como centros catalíticos para reacciones bioquímicas y ensamblaje de biomoléculas.^[12] Además, los condensados de densidad postsináptica median la señalización sináptica en las neuronas, y los condensados de señalización de receptores organizan la señalización de células T.^[13] Los condensados también contribuyen a la organización y la regulación transcripcional de la cromatina, por ejemplo los cuerpos de Balbiani en oocitos tempranos.^[14,15]1415

El centrosoma representa un condensado biomolecular vital y esencial para la división celular. Los condensados de material pericentriolar (PCM) en los centrosomas actúan como un centro de nucleación de microtúbulos durante la mitosis. Las propiedades líquidas de los condensados de PCM, que varían a lo largo del ciclo celular, le permiten reclutar o liberar dinámicamente nucleadores de microtúbulos, regulando así el ensamblaje y desensamblaje de microtúbulos. Estos condensados biomoleculares dinámicos ofrecen un soporte crítico para la organización estructural y funcional necesaria para la vida.^[16]

Coacervados – Modelos de los condensados biomoleculares

Los condensados biomoleculares tienen profundas implicaciones en las funciones celulares y en la vida. Por lo tanto, imitar estos compartimentos sin membrana en el laboratorio químico nos ofrece una comprensión mucho más profunda de su formación, dinámica y funciones. Además, dichos condensados sintéticos pueden utilizarse para llevar a cabo reacciones químicas, facilitar ensamblajes supramoleculares o ambos en entornos acuosos, proporcionando plataformas versátiles para estudiar y diseñar sistemas con características similares a las de la vida.

Estos condensados sintéticos se llaman coacervados, término acuñado por Hugo R. Kruyt y H. G. Bungenberg de Jong en 1929.^[18] Los coacervados son versiones sintéticas de los condensados biomoleculares con los bloques de construcción mínimos necesarios para la separación de fases. Se clasifican de manera general en tres categorías: (i) simples, (ii) complejos y (iii) auto-complejos, según el tipo de bloques de construcción e interacciones, ver figura 3(A).

Los coacervados simples están compuestos por un solo tipo de molécula donde las interacciones intermoleculares, como el apilamiento π-π, las interacciones aromáticas y las fuerzas de van der Waals, juegan un papel importante en la formación de gotas. Los coacervados complejos son los coacervados más comunes, compuestos por dos polímeros o un polímero y una molécula pequeña con cargas opuestas o un polímero y una molécula pequeña. Principalmente, existen dos factores que impulsan la coacervación de manera espontánea: (i) la interacción electrostática entre electrolitos de carga opuesta y (ii) el aumento de la entropía asociado a la liberación de los contraiones previamente ligados a los electrolitos constituyentes.^{[17-19]171819} Por su parte, los coacervados auto-complejos están formados por un único polímero con dominios cargados positiva y negativamente, donde las interacciones intra- e intermoleculares impulsan la separación de fases.^[20]

Espacio confinado de coacervado

Los compartimentos sin membrana ofrecen microambientes distintos que pueden aprovecharse para diversas funciones, ver figura 3(B). Mientras que los coacervados simples crean dominios apolares para acomodar sustratos hidrófobos, los coacervados complejos contienen una densa red de electrolitos cargados. Al seleccionar la mejor combinación de bloques de construcción, se puede ajustar la polaridad de los microambientes de los coacervados.

Dado que los coacervados constituyen una fase densa y rica en solutos, la concentración efectiva de agua en su interior es menor que la del medio circundante. Por lo tanto, ofrecen un espacio protegido frente a la hidrólisis y las interacciones de enlaces de hidrógeno. Como resultado, las moléculas se distribuyen preferentemente en estos compartimentos, lo que conduce a una concentración localmente elevada. La partición selectiva permite que los coacervados funcionen como una plataforma para la catálisis molecular. Más allá de los efectos de confinamiento, el interior de los coacervados puede imponer un ambiente de pH localizado. Además, las superficies de los coacervados pueden funcionar como análogos de las interfases catalíticas heterogéneas.^[21]

Aplicaciones de los coacervados

Se han aprovechado los beneficios de un espacio confinado pero sin membrana del coacervados, en una amplia gama de aplicaciones: (i) aislamiento selectivo de moléculas de una mezcla mediante secuestro molecular,^[22] (ii) liberación dirigida de fármacos u otras moléculas funcionales,^[23] (iii) uso de coacervados multi-compartimentados como análogo sintético de células biológicas,^[24] (iv) promoción del autoensamblaje y cristalización no clásica en entornos restringidos,^[25] y (v) funcionamiento como centros de reacción que facilitan la catálisis en medios acuosos, ver figura 4(A).^[26,27]2627

Estos microambientes ajustables permiten la partición selectiva de reactivos y productos, convirtiéndolos en excelentes microreactores para la catálisis. La ausencia de membranas permite un flujo de entrada y salida de reactivos y productos sin restricciones. Además, al ajustar la composición del coacervado, podemos controlar selectivamente los tipos de moléculas que pueden entrar en estos compartimentos. Esta selectividad permite que las reacciones procedan sin interferencia de inhibidores y competidores, ver figura 4(B).

Estas propiedades únicas hacen de los coacervados un modelo de protocélula viable, como lo propuso Oparin en 1924 (las protocélulas son precursoras de las primeras células vivas).^[28] Esto convierte a los coacervados en un sistema modelo para crear las células sintéticas con potencial aplicación en liberación de fármacos, biosensing y materiales inteligentes. En la última década, la emulación de la vida biológica en células sintéticas ha recibido gran atención y ahora la IUPAC ya la reconoce como una de las diez principales tecnologías emergentes en química.^[29]

Nuestra aportación en el campo

En los sistemas vivos, los autoensamblajes biológicos muestran una notable capacidad de adaptación al transitar por múltiples mínimos locales en paisajes energéticos complejos antes de alcanzar el equilibrio termodinámico. Los filamentos de actina y microtúbulos, que desempeñan un papel esencial en la rigidez celular, la migración celular y la división celular, son un ejemplo paradigmático.^[30] La coexistencia de distintas rutas cinéticas/fuera del equilibrio y termodinámicas que compiten por el mismo conjunto de monómeros, pero que dan lugar a autoensamblajes diferentes, se denomina complejidad de rutas. Diferencias sutiles en estas rutas pueden comprometer los autoensamblajes y sus funciones específicas. Por ejemplo, la pérdida de control sobre vías competidoras puede dar lugar a estructuras patológicas, como la agregación proteica aberrante e irreversible conocida como agregación amiloide, asociada a las enfermedades de Alzheimer y Parkinson.^[31] El esclarecimiento y el diseño de rutas complejas de autoensamblaje pueden, por tanto, ampliar nuestra comprensión de los procesos biológicos y contribuir al desarrollo de soluciones para diversas enfermedades.

En nuestro laboratorio también exploramos nuevas vías de autoensamblaje para dirigir monómeros de pequeñas moléculas hacia ensamblajes con distintas morfologías y funciones. Por ejemplo, hemos introducido una novedosa y compleja vía de autoensamblaje que se origina a partir de un coacervado simple del aminoácido leucina protegido con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Este sistema exhibe una evolución multidireccional desde una gota separada en fases hasta diferentes tipos de ensambles jerárquicos mediante múltiples intermediarios fuera del equilibrio, controlando el pH, la temperatura y las concentraciones de sal. Los ensamblajes de Fmoc-D-Leucina se inician mediante vías de nucleación clásicas y no clásicas, dando lugar a distintas estructuras metaestables (hidrogeles transitorios), cinéticas (hidrogeles estables) y termodinámicas, como policristales y láminas 2D, ver figura 5. Las condiciones químicas y térmicas iniciales dirigen a los monómeros hacia una vía de ensamblaje específica, lo que resulta en autoensamblajes metaestables con una disposición molecular distinta a la de los que han alcanzado el equilibrio. En muchos casos, los ensambles en equilibrio actúan como un sumidero termodinámico, agotando progresivamente los monómeros de las estructuras metaestables y dando lugar a materiales transitorios. Esta dinámica puede modularse química o térmicamente para ralentizar la disolución del hidrogel transitorio o evitar por completo los estados intermedios para alcanzar los ensamblajes de equilibrio final. Alternativamente, el estado metaestable puede controlarse cinéticamente para producir hidrogeles robustos y estables durante días. Esta navegación controlada de las vías de autoensamblaje ofrece una estrategia biomimética versátil para acceder a materiales en desequilibrio con propiedades a la carta y un amplio potencial de aplicación.^[25]

Durante la última década, la investigación sobre los coacervados ha crecido rápidamente, revelando su aplicación en una amplia gama de funciones, como la catálisis, la compartimentación, el secuestro molecular y su papel como centros para la autoorganización y la cristalización no clásica. Por ello, se han explorado diversas combinaciones de biomoléculas y biopolímeros con el fin de identificar la formulación óptima para la coacervación. Sin embargo, todavía carecemos de un diseño molecular racional de los bloques de construcción para la formación de coacervados. Para abordar esta carencia, presentamos una estrategia de novo para el diseño de bloques de construcción a medida destinados a la coacervación compleja. En concreto, nos centramos en bloques de construcción con cargas negativas derivados de moléculas orgánicas aromáticas. Estas pequeñas moléculas se sintetizan mediante una reacción entre L-cisteína y aldehídos aromáticos, dando lugar a un heterociclo de cinco miembros denominado tiazolidina (TD). Estos anillos de tiazolidina contienen un grupo carboxilato con carga negativa, que resulta crucial para las interacciones electrostáticas con electrolitos positivos y la consiguiente coacervación. Además, el núcleo aromático, junto con sus sustituciones, puede proporcionar una variedad de interacciones no covalentes que impulsan el sistema hacia la coacervación, ver figura 6.

Demostramos este enfoque mediante dos sistemas de coacervados que emplean una molécula con dos tiazolidinas derivada del 2,5-dimetoxitereftaldehído (OMe2TD), en combinación con uno de los siguientes electrolitos positivos: (i) un homopolímero de L-arginina (PA) o (ii) un surfactante (Sur). La primera combinación dio lugar a un coacervado hidrofílico con un tamaño de 1–2 μm, mientras que la segunda produjo un coacervado anfifílico con un tamaño superior a 10 μm (véase la Figura 6). Si bien los grupos tiazolidinas son esenciales para la coacervación, también cumplen una función muy importante en estas gotas: pueden utilizarse como centro de reacciones en estos sistemas. Así, un aldehído más reactivo, como el formaldehído (HCHO), puede extraer la cisteína de la tiazolidina y expulsar el aldehído aromático original (OMe2TD a OMe2CHO). Este aldehído liberado puede reaccionar fácilmente con un segundo sustrato adecuado, por ejemplo, con una amina, para formar una imina. De este modo, los nuevos bloques de construcción diseñados cumplen tres funciones: (i) solubilizar aldehídos orgánicos hidrofóbicos en agua, (ii) iniciar la separación de fases con un electrolito contrapuesto y (iii) restringir la reacción en ausencia de un desencadenante químico. Dado que estos coacervados están compuestos por moléculas reactivas desactivadas que pueden activarse selectivamente para llevar a cabo reacciones bajo demanda, denominamos a esta nueva clase de coacervados “coacervados reactivos”, ver figura 6.

Con el objetivo de evaluar la capacidad de los coacervados reactivos para llevar a cabo reacciones en sus microambientes y dirigir el autoensamblaje del producto, optamos por la reacción de condensación de iminas. Añadimos 1,4-fenildiamina a nuestros dos coacervados, impulsados por polímero y surfactante, e iniciamos la reacción con formaldehído. Tras la reacción, se generan oligómeros de imina altamente hidrofóbicos, que son susceptibles a la hidrólisis. Para reducir el contacto con las moléculas de agua, estos productos de imina se autoensamblan formando distintos tipos de estructuras jerárquicas en función del entorno del coacervado. Los coacervados hidrofílicos (compuestos por PA) experimentan una reacción y un autoensamblaje muy rápidos, dando lugar a microesferas sólidas (1–2 μm) formados por ensamblajes “frustrados” atrapados cineticamente. Dado que los enlaces imina son reversibles, el sistema se reajusta con el tiempo hacia una forma termodinámicamente más estable. Esto conduce a la evolución de pequeñas nanoesferas (~150 nm) a partir de la superficie de estas microesferas. Este proceso recuerda al fenómeno de gemación observado en sistemas vivos. En el caso de los coacervados anfifílicos (compuestos por Sur), la reacción y el autoensamblaje son considerablemente más lentos que en el caso anterior. Debido al carácter anfifílico de Sur, las iminas forman ensamblajes en la periferia en lugar de en el centro; esta reorganización da lugar a microesferas con un núcleo hueco. Así, se observa una transición desde gotas sin membrana a gotas con membrana, que evocan a las células vivas, ver figura 6. En resumen, al controlar el componente no reactivo de la coacervación reactiva, controlamos el microentorno del coacervado y, de este modo, dirigimos el autoensamblaje resultante hacia dos rutas distintas que exhiben propiedades similares a las de los sistemas vivos.

Conclusiones

El descubrimiento y la elucidación de los condensados ​​biomoleculares sin membrana constituyen un foco importante de investigación en biología celular, biología molecular, bioquímica y biofísica. Al aprovechar estos conceptos a través de sus homólogos sintéticos, los coacervados, obtenemos una plataforma sólida para ampliar las fronteras de la química de sistemas, la dinámica de desequilibrio, la catálisis orgánica y la cristalización. Además, las gotas de coacervados constituyen valiosos sistemas modelo para estudiar y comprender el papel de los condensados biomoleculares en los componentes básicos de la vida. Las gotas con separación de fases no solo son herramientas para la investigación fundamental, sino que también respaldan la investigación aplicada para generar nuevos materiales funcionales avanzados para el futuro.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento al proyecto PID2022-143047NA-I00 financiado por MICIU/AEI/10.13039/501100011033 y por FEDER, UE. También agradecimos a la Generalitat Valenciana por la ayuda CIDEGENT (CIDEXG/2022/16). SK agradece la beca predoctoral de la Universitat Jaume I: Programa Propio UJI (PREDOC/2024/03).